Агробактериальная трансформация

Агробактериальная трансформация — метод получения трансгенных растений путём введения Агробактериума (Agrobacterium) — почвенной бактерии, образующей опухоль при заражении растений.

Внедрение в жизнь биотехнологии целенаправленного получения трансгенных растений ускорила стыковка методов получения эмбриональных тканей из расти­тельных клеток и тканей посредством использования искусственных питательных сред, витаминов, гормонов и микроэлементов и выра­щивания этих тканей до зрелого растения с достижениями генетической инженерии.

Основной недостаток классического генетического метода изменения наследственности состоит в том, что при скрещивании двух организмов с разными генотипами происходит взаимная рекомбинация их ценных и не ценных в хозяйственном отношении генов. В результате в созданный сорт будут переходить, кроме тех генов, которые были желательны для генетика-исследователя, и гены, ухудшающие свойства сорта.

При применении метода агробактериальной трансформации данная проблема легко разрешается.

В клетку растения, сорт которого хотят улучшить, вводится ценный ген и из этой клетки выращивается зрелое растение. Для введения в клетку определённого гена в качестве векторной молекулы пользуются плазмидой почвенной бактерии Агробактериум. В природе при заражении этим видом бактерии растения повреждаются. В результате беспорядочного деления клеток заражённого растения на нем развивается опухоль, которая вызывается отрезком ТДНК (ДНК, вызывающая опухоль) генома Ti-плазмиды. В основе появления опухоли лежит встраивание ТДНК в геном растительной клетки и изменение ею свойств клетки (рис. 11). Эта особенность ТДНК широко используется в генной инженерии.

Довольно большой размер Ti-плазмиды Агробактериума (более 20 тысяч нуклеотидных пар) несколько затрудняет её использование в генной инженерии. Поэтому для перестройки наследственности растения методом генной инженерии при помощи рестриктазы получают отрезок ТДНК, плазмиды которого соединяют с плазмидой pBR 322 (пи-би-эр 322) и клонируют. Созданная искусственная плазмида несколько меньше, чем Ti-плазмида, и использование её намного легче и эффективнее. Такие молекулы (созданные искусственные плазмиды) называются векторными конструкциями. На отрезок ТДНК векторной конструкции пересаживают растительный ген. В результате этого ТДНК теряет способность вызывать опухоль, так как она уже разделена на два отрезка чужеродным геном.

Векторная конструкция, содержащая расчленённые ТДНК и чужеродный ген, внедряется в безвредные для растения специальные штаммы Агробактериума, Ti-плазмида которого не содержит ТДНК. При заражении растений этими бактериями Ti-плазмида Агробактериум с помощью своего специального аппарата трансформации встраивает чужеродный ген в геном растения. В последние годы разработаны методы внедрения в растительную или животную клет­ку чужеродного гена в составе векторной конструкции с помощью сверхмощного электрического поля или генных пушек. Однако эти методы применяются только в особых случаях из-за их технической сложности и дороговизны.

Из растительной клетки, подвергнутой трансформации, получают трансгенное растение (рис. 12). Материал с сайта http://wiki-what.com

Путём соединения Ti-плазмиды (1), полученной из Агробактериума, с плаз­мидой (2) с уникальным рестрикционным сайтом создаётся векторная конструкция (3). В отрезок ТДНК векторной конструкции рекомбиниру­ется чужой ген (4) и получается вектор (5) на основе Ti-плазмиды, не способной образовать опухоль. Этот вектор вво­дится в специальный штамм Агробак­териума c Ti-плазмидой, не содержащей участок ТДНК (6). При выращивании в искусственных условиях созданной рекомбинантной агробактерии (7) вмес­те с протопластом растения вектор (8) рекомбинируется в геноме растения.

В результате деления трансформированной растительной клетки образуется набор клеток, которые развиваются по определённой программе. Такой набор называется каллусной тканью. Отдельные клетки каллусной ткани под действием растительных гормонов или других регуляторных веществ начинают делиться по заданной программе. В результате из таких клеток поэтапно получают ткани растительного эмбриона и нормальное во всех отношениях, зрелое трансгенное растение. В хромосомах каждой его клетки содержится пересаженный ген. Поэтому, когда разведение трансгенного растения производится половым путём, пересаженный чужеродный ген передаётся по наследству.

Методом агробактериальной трансформации, например, выведены сорта хлопчатника и картофеля, которые отличаются устойчивостью к коробочному червю и колорадскому жуку.