Рекомбинантная ДНК [плазмида]

История получения

Получение рекомбинантной ДНК в искусственных условиях и клонирование генов впервые было осуществлено в 1972 г. американскими учёными Бойером и Коэном.

Хромосомную ДНК бактерии E. coli и её плазмиды они подвергали обработке в специальных пробирках ферментом рестриктазой Eco RI (Эко-эр-один), образующей «липкие» концы. В связи с тем, что в составе кольцевой плазмиды содержится только одна специфическая нуклеотидная последовательность, которую распознает и разрезает фермент рестриктаза Eco RI, этот фермент разрезает двойную цепь ДНК плазмиды только в одном месте и переводит кольцевую плазмиду в открытое состояние с «липкими» концами. Молекула ДНК хромосомы разделяется на столько отрезков, сколько она содержит специфических нуклеотидных последовательностей, которые могут быть распознаны ферментом рестриктазой Eco RI. Отрезки ДНК в сильном электрическом поле электрофоретической установки разделяются по величине, и выделенные отрезки окра­шиваются специальной краской. В результате образуются видимые невооружённым глазом наборы отрезков ДНК одной величины. Из электрофоретического геля можно выделить отрезок ДНК любой величины путём его растворения в воде. Таким способом Бойер и Коэн смешали в пробирке выделенный отрезок ДНК хромосомы с «липкими» концами и ДНК плазмиды, находящуюся в открытом состоянии, и сшили эти различные отрезки ДНК при помощи фермента лигазы с образованием ковалентной связи. В результате в состав плазмиды был введён отрезок ДНК хромосомы. Таким образом, была впервые создана рекомбинантная плазмида (рис. 10).

Открытие и автоматизация определения нуклеотидной после­довательности в молекуле ДНК, разделение отрезков ДНК посред­ством рестрикционных эндонуклеаз и высокоточных электрофорети­ческих установок, открытие устройств, синтезирующих гены по заданной программе, позволили не только получить рекомбинантную ДНК, но и ускорили процессы производства генно-инженерной продукции в промышленных масштабах. Материал с сайта http://wiki-what.com

В этой молекулярной конструкции ДНК плазмиды выполняет векторную (направляющую) функцию, поскольку плазмиды могут рекомбинироваться в хромосомной ДНК. Эта векторная конструкция в силу наличия в ней гена устойчивости к антибиотикам была введена в бесплазмидную, т. е. неустойчивую к антибиотикам бактериальную клетку. Бактерии с рекомбинантными плазмидами в силу того, что они имеют ген устойчивости к антибиотикам, в отличие от бесплазмидных бактерий, не погибают в питательной среде, содержащей антибиотик. Поэтому в опытную пробирку вводится антибиотик и выделяется клон рекомбинантной бактерии, который затем выращивается. В каждой бактерии, составляющей данный клон, будет содержаться отрезок чужой (гетерологичной) ДНК, и этот отрезок может размножаться по мере размножения бактериальной биомассы. Кроме того, если реком­бинантная плазмида обладает способностью к автономной репликации, то отрезок чужой ДНК может размножаться ещё десятки раз. Размножение чужой ДНК посредством векторной конструкции называется клонированием генов. В качестве вектора при клони­ровании отрезков ДНК могут быть использованы вирусные и фаговые молекулы ДНК или блуждающие гены.